Биологи четверть века искали убийцу орланов в Арканзасе — и, наконец, нашли

В середине 1990 годов на водохранилище в американском штате Арканзас нашли несколько десятков погибших белоголовых орланов. В следующие десятилетия похожие случаи стали отмечаться по всему юго-востоку США — причем помимо пернатых хищников жертвами неизвестного убийцы становились утки и другие водоплавающие птицы. На то, чтобы разрешить загадку гибели орланов, у ученых ушло больше четверти века. Рассказываем, как развивался запутанный сюжет, в котором помимо орлов оказались замешаны вид-иммигрант, его верный компаньон и неудачная попытка исправить нанесенный природе ущерб.

Место преступления

В 1972 году люди перегородили арканзасскую реку Кэддо плотиной и заставили вращать турбины гидроэлектростанции. Земли выше по течению, где индейцы когда-то выращивали тыкву и кукурузу, а европейские колонисты охотились на пушного зверя, ушли под воду. Искусственное озеро площадью около 57 квадратных километров нарекли водохранилищем Дигрей (DeGray Lake).

Водохранилище Дигрей, штат Арканзас.Armyman / Flickr / CC BY-NC 2.0

В наши дни водоем стал центром притяжения для многочисленных туристов, которые приезжают сюда порыбачить и отдохнуть у воды. Дигрей привлекает не только людей, но и околоводных птиц — они останавливаются здесь во время миграций или проводят холодное время года. Например, на водохранилище ежегодно зимуют величественные белоголовые орланы (Haliaeetus leucocephalus) — пернатые символы США, изображение одного из которых украшает герб этой страны.

Однако зимой 1994-95 годов пернатые хищники на Дигрее внезапно стали умирать. С конца ноября по середину января здесь нашли 29 погибших или умирающих орланов. Последние вели себя странно: беспокойно перелетали с ветки на ветку и врезались в скалы. Нескольких хищников поймали и попытались вылечить — но птицам ничего не помогло. Пока специалисты бились за жизни орланов, схожие симптомы начали проявлять американские лысухи (Fulica americana), водоплавающие птицы из родственного журавлям семейства пастушковых (Rallidae). Они отказывались летать и, казалось, потеряли координацию. Ничего подобного за 22 года существования водохранилища не происходило.

Следующая зима на водохранилище прошла без происшествий — лишь в марте 1996 года здесь заметили одного орлана, который вел себя необычно. А осенью на Дигрее вновь начали умирать его сородичи. Более того, массовую гибель орланов также зафиксировали на Уошито, еще одном водохранилище неподалеку. В общей сложности к 25 января 1997 года умерло несколько десятков орланов. Загадочные проблемы со здоровьем вновь поразили и американских лысух — примерно пять процентов всей популяции на Дигрее. Правда, они, кажется, справлялись с недугом лучше: несмотря на интенсивные поиски, найти на берегах водохранилища мертвых лысух не удалось. Среди других птиц случаев гибели или необычного поведения не отмечалось.

Массовая гибель диких животных всегда вызывает тревогу у зоологов. В данном случае поводов для нее было больше, чем обычно. В середине XX века белоголовые орланы едва не вымерли из-за уничтожения среды обитания, отстрела и массового использования инсектицида ДДТ (он накапливается в организме хищных птиц и приводит к истончению скорлупы, что резко снижает репродуктивный успех). По оценкам орнитологов, в 1963 году во всех штатах США кроме Аляски осталось всего около 417 пар орланов. Для сравнения, в начале XVIII века их было от 300 тысяч до полумиллиона особей.

Благодаря ряду природоохранных мер, самой действенной из которых, вероятно, был запрет на использование ДДТ на территории США, численность белоголовых орланов во второй половине века стала постепенно восстанавливаться. К 1992 году общая популяция вида достигла 112 000-115 000 особей, большая часть из которых обитала на Аляске и в Канаде, и вскоре ее исключили из официального списка видов под угрозой вымирания.

Белоголовый орлан (Haliaeetus leucocephalus) на АляскеAndy Morffew / Flickr / CC BY 2.0

Спасение белоголовых орланов — яркий пример того, как слаженные действия могут предотвратить вымирание вида. Однако происходящее на водохранилище Дигрей грозило перечеркнуть этот успех. Хотя за две зимы умерло менее сотни особей, для таких долгоживущих и медленно размножающихся видов это значительная потеря. Кроме того, специалисты опасались, что мор может перекинуться и на другие регионы. В таком случае гибель орланов в Арканзасе могла быть всего лишь предвестником грядущего кризиса. А странное поведение лысух указывало, что беспокоиться следует и за других околоводных птиц.

Главной проблемой было то, что причина происходящего оставалась неизвестной. Что это — болезнь? Отравление? Или вообще результат какой-нибудь сложной цепочки экологических событий?

Список подозреваемых

В попытке установить причину гибели птиц специалисты сразу после событий в Арканзасе провели вскрытие 26 погибших орланов (а также 77 лысух со странным поведением, которых добыли специально для исследования). На первый взгляд птицы выглядели здоровыми: в частности, у них не было никаких признаков истощения. Однако более тщательный анализ показал, что у всех орланов и 81 процента лысух повреждено белое вещество головного и спинного мозга. Миелинизированные ткани их центральной нервной системы стали напоминать губку из-за многочисленных вакуолей диаметром от пяти до 80 микрометров. Судя по всему, именно эти повреждения стали причиной потери координации и смерти.

Оптический тектум погибшего орлана с водохранилища Дигрей с многочисленными вакуолями в миелинизированной ткани. Размер шкалы — шесть микрометровN. J. Thomas et al. / Veterinary Pathology, 1998

Ранее у диких птиц никогда не наблюдали подобных симптомов. Недуг, поразивший орланов и лысух, назвали вакуолярной миелинопатией птиц (avian vacuolar myelinopathy; AVM). При этом оставалось неясным, что именно вызвало столь масштабное повреждение нервной ткани. В статье 1998 года, посвященной AVM, приводится внушительный список веществ, способных привести к миелинопатии: пестициды гексахлорофен, триэтилтин и брометалин, противотуберкулезный препарат гидразид изоникотиновой кислоты (изониазид) и даже токсины некоторых экзотических растений. Обнаружить следы хотя бы одного из них в тканях погибших орланов ученым не удалось.

Между тем, как и опасались орнитологи, птицы начали гибнуть и на других пресноводных водоемах. AVM постепенно распространялась по юго-востоку США от Техаса до Северной Каролины, унося жизни белоголовых орланов и других хищных птиц, а также лысух, крякв (Anas platyrhynchos), кольчатых чернетей (Aythya collaris) и канадских казарок (Branta canadensis). Одних только орланов за восемь лет с первого инцидента на водохранилище Дигрей умерло несколько сотен. В общей сложности вспышки заболевания зафиксировали в одиннадцати точках на территории шести штатов. Всякий раз это происходило поздней осенью или зимой на искусственных водоемах, поросших густой водной растительностью.

Когда специалисты выпускали здоровых лысух и уток в водоемы во время вспышки миелинопатии, те начинали проявлять симптомы болезни в течение пяти дней. Это означало, что источник проблемы находится в воде или около нее. Анализ тканей погибших птиц вновь не выявил присутствия пестицидов или медицинских препаратов, которые могли бы спровоцировать болезнь. Не нашли их и в донных отложениях. В результате гексахлорофен, триэтилтин, брометалин и изониазид выбыли из списка подозреваемых. При этом заболевшие птицы не заражали здоровых, что исключало инфекционную природу AVM. Таким образом, причиной гибели птиц должен был быть некий неизвестный природный нейротоксин, появляющийся лишь в определенное время года.

Убийца

Исследования ученых, которые пытаются установить причины сокращения численности определенных видов или массовой гибели животных, нередко напоминают работу сыщика. Специалисты, бившиеся над тайной гибели орланов, также применили классический детективный прием: они изучили все вспышки болезни и попытались выяснить, что между ними общего. В 2005 году команда под руководством Сьюзен Уайлд (Susan B. Wilde) из Университета Южной Каролины установила, что во всех водоемах, где были зафиксированы вспышки AVM, присутствует гидрилла мутовчатая (Hydrilla verticillata), водное растение из семейства водокрасовых (Hydrocharitaceae). Естественный ареал этого вида охватывает Африку, Азию и Австралию. В США гидриллу завезли в 1960 годах (примерно в те же года на реке Кэддо начали возводить дамбу) — и инвазивный вид начал заполонять водоемы, ухудшая качество воды, мешая судоходству и выработке электричества на гидроэлектростанциях. Но как растение могло убить орланов?

Густые заросли гидриллы мутовчатой (Hydrilla verticillata) в индийском прудуJ.M.Garg / Wikimedia Commons / CC BY 3.0

Ответ на этот вопрос нашелся, когда команда Уайлд изучила листья гидриллы под микроскопом. Оказалось, что они плотно заселены ветвящимися цианобактериями неизвестного ранее вида и рода.

Некоторые планктонные цианобактерии производят токсины, способные навредить здоровью животных и человека. Особенно опасными они становятся в период массового размножения — так называемого цветения воды. Неудивительно, что именно новая цианобактерия стала главным подозреваемым в массовой гибели птиц. Это отразилось в ее официальном латинском названии, присвоенном в 2014 году. Вид получил научное имя Aetokthonos hydrillicola — то есть «убийца орлов, живущий на гидрилле».

Aetokthonos hydrillicola под световым микроскопом. Размер шкалы — 10 микрометровSusan B. Wilde et al. / Phytotaxa, 2014

Флуоресцирующие колонии Aetokthonos hydrillicola на листе гидриллы мутовчатой (Hydrilla verticillata).Susan Wilde

Ученые установили, что на водоемах, где произошли вспышки AVM, до 95 процентов площади листьев гидрилл покрыты эпифитными цианобактериями. В то же время там, где на гидриллах не росли A. hydrillicola, случаев миелинопатии не отмечалось.

Наблюдения в природе и эксперименты в лаборатории показали, что растительноядные птицы начинают проявлять симптомы миелинопатии, поев листьев гидриллы, покрытых A. hydrillicola. Орланы и другие хищные птицы, конечно, не питаются растениями — однако они кормятся мясом ослабевших и умерших от AVM лысух и уток. В результате предполагаемый нейротоксин цианобактерий может подняться по пищевой цепочке и аккумулироваться в телах пернатых хищников. Это объясняет, почему орланы на Дигрее пострадали сильнее, чем лысухи.

Более того, оказалось, что миелинопатия угрожает не только птицам. Рыбы, амфибии и рептилии тоже проявляли признаки болезни и умирали, съев заселенные цианобактерией растения или мясо животных, которые на них кормились. Так вакуолярная миелинопатия птиц стала вакуолярной миелинопатией (VM) — без упоминания птиц. В теории VM может угрожать и людям, которые съедят мясо зараженных рыб или водоплавающих птиц, хотя до сих пор подобных случаев не фиксировалось.

Алиби?

Казалось бы, дело раскрыто: в гибели орланов виноваты токсичные цианобактерии, растущие на инвазивном растении. Однако на самом деле вопросов оставалось немало. Например, какое именно химическое вещество превращает нервные ткани животных в губку? И почему вспышки VM, несмотря на широкое распространение гидриллы, случаются не на каждом водоеме?

Чтобы ответить на них, Сьюзен Уалйд (которая к этому времени сменила место работы на Университет Джорджии) и ее коллегам из нескольких институтов в США, Германии и Чехии пришлось продолжить исследования. Обследовав 69 водоемов на юго-востоке США, исследователи выяснили, что в 31 из них листья гидрилл заселены цианобактериями A. hydrillicola. В основном речь идет о водохранилищах, фермерских прудах и озерах, используемых для отдыха. По мнению авторов, реальное распространение опасного микроорганизма может быть еще более широким.

Карта юго-востока США. Зеленые участки иллюстрируют распространение гидриллы. На красных участках подтверждено присутствие цианобактерий Aetokthonos hydrillicola, а в пробах с желтых участков они не наблюдались. Заштрихованные участки соответствуют местностям, где произошли вспышки вакуолярной миелинопатииSusan B. Wilde et al. / Science, 2021

В 2011 году исследователи решили наладить выращивание A. hydrillicola в лабораторных условиях — это облегчило бы изучение данного вида и его предполагаемых токсинов. Они изолировали цианобактерий с образцов гидриллы, собранных в водохранилище имени Строма Термонда на границе штатов Джорджия и Южная Каролина, и приступили к культивации. Микроорганизмы росли неохотно, так что у команды ушло около двух лет, чтобы подобрать необходимые условия и получить объем биомассы, достаточный для проведения экспериментов.

К удивлению Уайлд и ее коллег, когда выращенные в лаборатории A. hydrillicola скормили курам, те остались здоровыми. Никаких признаков миелинопатии птицы не проявляли. Неужели цианобактерии зря обвинили в гибели орланов?

Исследователи предположили, что колонии A. hydrillicola накапливают нейротоксины только когда растут в дикой природе. Чтобы проверить эту идею, они сравнили цианобактерии, выращенные в лаборатории, с собранными на участках, где фиксировались вспышки VM. С помощью масс-спектрального анализа удалось установить, что в диких образцах A. hydrillicola действительно содержится метаболит с простейшей формулой C17H6Br5N3, которого нет в культурных колониях.

Уайлд и ее соавторы не обнаружили упоминаний о подобном соединении в базах данных пестицидов, удобрений или лекарственных препаратов. Это указывало, что цианобактерии не накопили в себе химическое вещество, произведенное людьми, а синтезировали его самостоятельно. При этом исследователи отметили, что предполагаемый токсин содержит пять атомов брома. Молекулы пестицидов брометалина и гексахлорофена, способные вызывать губчатую миелинопатию у птиц и млекопитающих, также содержат по несколько атомов галогенов.

Стандартная среда, в которой ученые культивировали A. hydrillicola, не содержала брома. Именно поэтому цианобактерии не причинили вреда курам — у них просто не было необходимых ингредиентов для производства нейротоксина. А когда среду обогатили бромидом калия, микроорганизмы начали исправно синтезировать предполагаемый токсин. Интенсивнее всего синтез токсина у бактерий шел при концентрациях KBr в диапазоне от 0,1×10-3 до 0,5×10-3 моль на литр. Кроме того, A. hydrillicola синтезировали больше яда в условиях стресса: например, когда их начинали перемещать или при понижении температуры с 28 градусов Цельсия до 21 градуса Цельсия. Это объясняло, почему все случаи VM происходили в холодное время года.

На следующем этапе Уайлд и ее коллеги сопоставили образцы гидрилл и растущих на них цианобактерий из разных водоемов на юго-востоке США. Присутствие предполагаемого токсина удалось зафиксировать только там, где отмечались вспышки миелинопатии. Кроме того, следы C17H6Br5N3 нашлись в тканях двух лысух, погибших во время вспышки VM на водохранилище имени Строма Термонда в ноябре 2014 года. Это подтверждало, что данный метаболит всасывается в кишечнике птиц.

Пик концентрации предполагаемого токсина в колониях цианобактерий наблюдался в ноябре. За несколько месяцев до этого, в конце лета, водоемы на юго-востоке США стратифицируются по вертикали на два слоя. Сверху вода хорошо прогревается солнечными лучами и насыщается кислородом, а ближе ко дну, куда свет не проникает, остается холодной и бедной кислородом. К концу осени верхний слой остывает и перемешивается с нижним, а гидриллы постепенно отмирают. Измерения показывают, что в тканях этих растений содержится большое количество брома (в 20 раз больше, чем в донных отложениях, и в 500-1000 раз больше, чем в воде) — и когда они распадаются, данное соединение оказывается в воде. Вероятно, эти сезонные изменения подвергают цианобактерии стрессу и подталкивают к производству токсина, одновременно обеспечивая их необходимым для этого сырьем.

Орудие убийства

Новый токсин назвали этоктонотоксином (aetokthonotoxin; AETX) — в честь бактерии, из которой его выделили. В буквальном переводе это слово означает «яд, убивающий орлов». Ученые реконструировали химическую структуру данного соединения — оно оказалось пентабромированным индольным алкалоидом. Несмотря на то, что живые организмы нередко производят броморганические соединения (к ним относится, например, 6,6’-диброминдиго — основной компонент знаменитого тирского пурпура, который выделяли из морских брюхоногих моллюсков), некоторые химические характеристики этоктонотоксина никогда раньше не отмечались в живой природе.

Структурная формула этоктонотоксина.Susan B. Wilde et al. / Science, 2021

Чтобы понять, как именно A. hydrillicola производит убивающий птиц токсин, исследователи секвенировали геномы этих цианобактерий, взяв за основу образцы, собранные в 2011 и 2014 годах в водохранилище имени Строма Термонда. В результате они выявили кластер из шести генов, вероятно, участвующих в синтезе этоктонотоксина (aetA-aetF). Ни у одного другого биологического вида, чьи геномы уже секвенировали, подобные комплексы генов не известны. При этом, судя по соседним генам, A. hydrillicola приобрела их самостоятельно в процессе эволюции, а не позаимствовала у какого-то другого организма за счет горизонтального переноса.

Уайлд с соавторами пока не установили конкретные функции каждого из aet-генов. Однако они предположили, что aetE кодирует фермент триптофаназу, который обеспечивает расщепление триптофана с образованием индола. Вероятно, именно так образуются два индольных кольца этоктонотоксина. Гены aetA и aetF, судя по всему, отвечают за синтез двух разных ферментов галогеназ, которые помогают включить в состав токсина атомы брома. Последующие эксперименты подтвердили, что белок AetF действительно помогает триптофану приобрести два атома брома в позициях, которые характерны для одного из индольных колец этоктонотоксина. Чтобы выяснить, как токсин получает оставшиеся атомы брома, необходимо подробнее изучить работу белка AetA.

В экспериментах с модельными организмами этоктонотоксин оказался смертелен для нематод Caenorhabditis elegans, дафний Ceriodaphnia dubia и мальков данио-рерио (Danio rerio). Сублетальные дозы токсина снизили репродуктивный успех нематод, а также вызвали повреждение нервной системы у данио. Рыбки дрожали всем телом, глотали воду, теряли равновесие и не пытались сбежать, когда исследователи дотрагивались до них зондом.

Наконец, на последнем этапе исследования Уайлд и ее коллеги проверили действие этоктонотоксина на птицах. Подопытным курам в пищевод четыре раза в течение восьми дней вводили чистый токсин или экстракт гидриллы с содержащими токсин цианобактериями. Куры из контрольной группы получили дозу растворителя диметилсульфоксида.

Несмотря на то, что ни в одной из групп птицы не проявляли симптомов миелинопатии (возможно, из-за короткой продолжительности эксперимента), ее признаки удалось обнаружить в ходе гистологического исследования. У особей, получавших чистый токсин или экстракт гидриллы, в белом веществе ствола головного мозга, оптического тектума и мозжечка образовались многочисленные вакуоли. Похожее поражение нервной ткани было обнаружено больше двадцати пяти лет назад у орланов и лысух, пострадавших от вспышки VM на водохранилище Дигрей. При этом у птиц из контрольной группы белое вещество осталось нормальным. Иными словами, эксперимент окончательно доказал, что причиной вакуолярной миелинопатии является этоктонотоксин цианобактерий A. hydrillicola.

Срезы мозжечка у кур из контрольной группы (CNT) и двух экспериментальных (HTX и AETX). Птицы из группы HTX получили экстракт гидриллы с цианобактериями, а из группы AETX – чистый этоктонотоксин. В обоих случаях в белом веществе возникли многочисленные вакуоли – симптом вакуолярной миелинопатии. У птиц из контрольной группы нервная ткань не претерпела каких-либо измененийSusan B. Wilde et al. / Science, 2021

Соучастники

Научная статья, в которой команда Сьюзен Уайлд доказывает связь между этоктонотоксином и вспышками VM, вышла в журнале Science 25 марта 2021 года. Впрочем, это, конечно, еще не конец истории, которая началась в Арканзасе в ноябре 1994 года. Как отмечают исследователи, теперь им предстоит выяснить, откуда именно поступает бром, который используется для синтеза токсина. Судя по всему, его источник — отмирающие ткани гидриллы, но как он попадает в само растение, остается неясным.

Бром, который аккумулирует гидрилла, вполне может иметь естественное происхождение. Однако высока вероятность, что он поступает в водоемы благодаря деятельности человека. Как мы уже упоминали выше, гидрилла считается опасным инвазивным видом и с ней активно борются. В частности, для прореживания ее зарослей, а также для уничтожения других инвазивных растений, используют бромсодержащий гербицид дикват дибромид. В теории он может приводить к накоплению бромидов в тканях гидриллы и после ее отмирания обеспечивать A. hydrillicola сырьем для синтеза токсина. Если эта гипотеза верна, то, пытаясь уничтожить инвазивное растение, люди делают его еще более опасным.

Учитывая это, Уайлд и ее коллеги рекомендуют с осторожностью использовать бромсодержащие гербициды в водоемах. Альтернативным решением может быть контроль инвазивной растительности с помощью стерильных триплоидных особей белых амуров (Ctenopharyngodon idella). Эти крупные растительноядные рыбы уже показали свою эффективность против гидриллы, в том числе на водохранилищах Дигрей и имени Строма Термонда. Как отмечают исследователи, борьба с этим инвазивным растением — залог того, что птицы и другие животные будут реже погибать от вакуолярной миелинопатии.

Белый амур (Ctenopharyngodon idella) – биологическое оружие против инвазивных водяных растенийHarka, Akos / Wikimedia Commons / CC BY 3.0

Вопреки опасениям орнитологов, VM не нанесла серьезного урона популяции белоголовых орланов. По последним данным, численность этих птиц в 48 континентальных штатах США продолжает расти и достигла трехсот тысяч особей. Среди них — около 71 400 размножающихся пар. Тем не менее, не следует недооценивать влияние этоктонотоксинов на экосистемы, особенно в долгосрочной перспективе. Полностью избавить американские водоемы от гидриллы вряд ли получится, так что специалистам остается лишь пытаться снизить наносимый ей ущерб, а также тщательно отслеживать вспышки миелинопатии и их влияние на численность уязвимых видов.

Смерть орланов на водохранилище Дигрей, с которой начались исследования вакуолярной миелинопатии и этоктонотоксина, — не первый и не последний случай массовой гибели диких животных. Например, летом прошлого года в Ботсване от отравления водой с цианобактериями погибло более трехсот слонов. Причины многих подобных историй на первый взгляд кажутся естественными. Однако трагедия арканзасских орланов демонстрирует, что при пристальном изучении даже в таких ситуациях в конце концов обнаруживается человеческий след. Люди не только завезли в Северную Америку инвазивную гидриллу, но и, возможно, выбрали неправильное орудие для борьбы с ней. А гибель слонов может быть связана с антропогенными климатическими изменениями: из-за них погода становится более жаркой, что благоприятствует бурному размножению цианобактерий. Похоже, что в антропоцене нулевой гипотезой при изучении массовой гибели животных следует считать человеческую деятельность.

Автор: Сергей Коленов

Источник